Nährbodenherstellung

notwendige Geräte und Utensilien:

notwendiges Verbrauchsmaterial:

Kulturgefäße für die Aussaat (Muttergefäße)

Eprouvetten sind für Aussaat ideal, weil diese sehr wenig Platz einnehmen, wenig Nährboden benötigt wird und Kontaminationen auf einzelne Eprouvetten begrenzt bleiben. Außerdem haben Eprouvetten beim Arbeiten über Wasserdampf den Vorteil, dass sich der Nährboden und die sich darauf befindlichen Protokorme bzw. Pflanzen nur sehr wenig erhitzen, weil sie sich aufgrund der Länge der Eprouvetten außerhalb des Dampfes befinden.

Kulturgefäße fürs Umlegen

Grundsätzlich sollten die Gläser hoch genug sein (ca. 10 cm), damit die Pflanzen ausreichend groß werden können bevor man sie akklimatisiert. Abhängig davon, ob man über Wasserdampf oder in einer sterilen Werkbank arbeitet, ist der Durchmesser der Öffnung der Gläser anzupassen. Über Wasserdampf sollten die Öffnung klein sein, weil der Arbeitsbereich sehr begrenzt ist. Für das Arbeiten in einer sterilen Werkbank kann man Gläser mit einer größeren Öffnung verwenden, das erleichtert das Arbeiten.

Vorbereiten der Kulturgläser

Bevor man die Gläser für die in vitro Kultur verwenden kann, muß man diese gründlich von Etiketten und eventuell vorhandenen Speiseresten reinigen. Hierfür eigenen sich Lösungsmittel (z.B. Nitroverdünnung) recht gut, wobei aber wichtig ist, dass die Gläser nach dem Reinigen gut abgewaschen werden um Lösungsmittelrückstände zu entfernen. Der Deckel sollte gut schließen und darf beim Reinigen nicht vergessen werden. Die sauberen Gläser werden jetzt mit einem Stück Küchenrolle trockengerieben und verschlossen bis zu deren Einsatz aufbewahrt. Da das Trockenreiben von Eprouvetten (speziell deren Innenseite) eher mühselig ist, spülen wir unsere Eprouvetten nach dem Waschen mit destilliertem Wasser aus, trocknen nur die Aussenseite ab und lassen sie an der Luft trocknen. So vermeiden wir lästige Kalkflecken in den Eprouvetten und ersparen uns das Trockenreiben der Innenseite.

WICHTIG: Da die Gläser beim Sterilisieren im Druckkochtopf 121° aushalten müssen, sind sie auf deren Tauglichkeit zu überprüfen. Die Gläser dürfen keinen Kunststoffdeckel haben.

Ansetzen des Nährbodens (Medium)

1. Die notwendige Menge an Pulver für den Nährboden (siehe Beipackzettel oder Aufdruck auf der Flasche) mit Hilfe einer Briefwaage abwiegen.

2. Ist im Medium kein Geliermittel enthalten (siehe Beipackzettel), muss man noch Geliermittel (z.B. Agar-Agar) vorbereiten. Wir verwenden für unsere Nährböden 6 - 7 g Agar-Agar pro Liter Medium.

3. Das für die gewünschte Nährbodenmenge nötige destillierte Wasser in den Kochtopf geben und das Nährbodenpulver einrühren.

4. Den pH-Wert mit Hilfe von Teststreifen oder einem pH-Meter feststellen und gegebenenfalls korrigieren. Der pH-Wert sollte bei ca. 5.6 liegen. Mit verdünnter Salzsäure (HCl) kann man den Wert senken, mit verdünnter Natronlauge (NaOH) erhöhen.

Der Sigma Nährboden P6668 ist bereits voreingestellt und muss nicht justiert werden.

5. Jetzt kann man den Kochtopf auf den Küchenherd stellen und das Medium erhitzen.

6. Sobald die ersten Dampfblasen vom Boden des Becherglases aufsteigen, beginnt man mit dem Einrühren des Geliermittels (falls dieses nicht schon im Nährbodenpulver enthalten ist).

7. Das Medium ca. 2 Minuten leicht kochen lassen, wobei man aber darauf achten muss, dass das Medium nicht aufschäumt.

8. Den flüssigen Nährboden in die Kulturgefäße füllen und darauf achten, dass das Nährmedium nicht auf den Hals der Kulturgefäße kommt, weil sonst Kontaminationen (Pilze, ...) sehr leicht in das Gefäß kommen können. Bei sehr engen Gefäßen (z.B. Eprouvetten, Flaschen, ...) ist ein Glastrichter sehr zu empfehlen.

Medium in die Gläser füllen

9. Die Deckel der Kulturgefäße auf die befüllten Gläser legen, diese aber nicht festschrauben, um Schäden beim Sterilisieren zu vermeiden. Hat ein Gefäß (z.B. Eprouvette, Flasche) keinen hitzebeständigen Schraubverschluß, muss man in die Öffnung einen Wattpfropfen stecken.

verschlossene Gläser

10. Im nächsten Schritt werden die Gefäße mit Alufolie abgedeckt. Bei Eprouvetten ist es empfehlenswert diese in ein Drahtgestell zu stellen und dieses mit Alufolie zu umwickeln, damit die einzelnen Alufolienkappen nicht abgehoben werden (beim Erhitzen entweicht Luft, die die Folie sonst wegschiebt).

Gläser mit Alufolie verschliessen

11. Die Mindestmenge an Wasser (siehe Beschreibung des Druckkochtopfs) in den Druckkochtopf füllen, den Einsatz, der die Gläser über dem Wasser hält, in den Topf geben und die Gläser bzw. Eprouvetten mit dem Nährboden in den Einsatz stellen.

Gläser i Druckkochtopf

12. Den Druckkochtopf schließen und auf dem Herd solange erhitzen, bis eine Temperatur von etwa 120° und 0,8 bar Druck erreicht sind. Bei unserem Druckkochtopf bedeutet das, dass der zweite Ring am Ventil sichtbar sein muss. Dieser Druck und die Temperatur muss für die nächsten 15 Minuten gehalten werden.

13. Nach 15 Minuten schaltet man den Herd ab und lässt den Druckkochtopf vollständig abkühlen.

13. Sind die Gläser abgekühlt, am besten über Nacht, nimmt man sie vorsichtig aus dem Druckkochtopf ohne deren losen Deck anzuheben, schraubt die Deckel fest, schreibt das aktuelle Datum auf jedes Glas und bewahrt sie für mindestens eine Woche auf. Die Gläser können verarbeitet werden, wenn sie nach einer Woche frei von Kontaminationen sind.

Herstellen von sterilen destillierten Wasser

Um steriles destilliertes Wasser zum Spülen der Samen zu bekommen, füllt man die benötigte Menge steriles Wasser in ein verschraubbares Glas, legt den Deckel lose auf das Glas und deckt den Deckel mit Alufolie ab. Das Glas kann gemeinsam mit den Nährböden im Druckkochtopf sterilisiert werden.

Von uns verwendete Nährböden:

Aussaat P668 (bei Sigma P6668)
Umlegen P748 (bei Sigma P1056 aber ohne Agar-Agar)
Nodienkultur P793 (bei Sigma P6793)

Autor: Thomas Ederer