Die Aussaat reifer Samen

Bei der Aussaat von reifen Samen wartet man solange, bis sich die Samenkapsel der Orchidee von selbst öffnet und die Samen freigibt. Sobald die Kapsel aufspringt, schneidet man die Kapsel ab und schüttelt die losen Samen heraus (z.B. auf ein Stück Papier). Die Samen müssen vor dem Aufbringen auf den Nährboden von Verunreinigungen (z.B. Stücke der Kapsel, Pollenschläuche, ...) befreit und anschließend sterilisiert werden.

notwendige Geräte und Utensilien:

notwendiges Verbrauchsmaterial:

Vorteile von reifen Samen:

  • sie können im Kühlschrank aufgehoben werden

Nachteile von reifen Samen:

  • höhere Kontaminationsgefahr als bei der Aussaat aus grünen Kapseln
  • etwas aufwendiger zu Sterilisieren als grüne Samenkapseln
  • man muss die komplette Reifedauer der Kapsel abwarten

Vorbereiten des Arbeitsplatzes:

Bei der hier beschrieben Methode wird der aufsteigende Wasserdampf über dem Kochtopf als steriler Arbeitsbereich genutzt. Sehr wichtig ist, dass in dem Raum jede vermeidbare Zugluft unterbunden wird (Fenster schließen). Wie man die einzelnen Komponenten aufstellt, kann man nur durch Probieren herausfinden. Bei uns (Rechtshänder) hat sich folgende Aufstellordnung als am besten erwiesen. Der Spiritusbrenner steht so nah wie möglich rechts neben dem Kochtopf auf einem Korkuntersetzter (für Kochtöpfe). Rechts neben dem Spiritusbrenner befindet sich das Fläschchen mit 70 % Ethanol, in dem alle Instrumente (Pinzette, Impföse) stehen und dort auf ihren Einsatz warten. Unmittelbar links neben dem Topf befindet sich ein in Ethanol getränktes Küchentuch, auf dem die Alukappen abgestellt werden. Weiter links befinden sich die Kulturgläser mit den Nährmedien (auf dem Bild unten nicht zu sehen).

steriler Arbeitsplatz

steriler Arbeitsplatz

Herstellen der 3 % Wasserstoffperoxid Desinfektionslösung:

Um von der hochkonzentrierten Lösung (z.B. 30 %) eine gebrauchfertige Lösung mit 3 % zu erhalten, muß die hochprozentige Lösung mit destilliertem Wasser verdünnt werden. Mit der untenstehenden Formel kann man auf einfache Weise errechnen, wieviel hochprozentiger Wasserstoffperoxid (H2O2) für eine bestimmte Menge 3 % H2O2 benötigt wird.

Beispiel:

gewünschte Menge 3 % Wasserstoffperoxid: 100 ml
Konzentration der hochprozentigen Lösung: 30 %

Formel: Mengehochprozentig = (Mengegesamt * Konzentrationniedrig) : Konzentrationhoch = (100 ml * 3 %) : 30 % = 10 ml

In diesem Bespiel müsste man 10 ml 30 % H2O2 in ein Becherglas geben und mit destilliertem Wasser auf 100 ml auffüllen, damit diese 100 ml eine Konzentration von 3 % H2O2 haben.

Weitere Arbeitsgänge:

Nachdem die Desinfektionslösung zur weiteren Verwendung bereit steht, wird in den Kochtopf etwa 3 cm Wasser gefüllt und zum Kochen gebracht. Die Temperatur der Herdplatte ist so zu wählen, dass das Wasser immer kocht. Sobald das Wasser kocht, nimmt man den Deckel von Topf, reinigt den Gitterrost mit einem Stück in 70 % Ethanol getränkter Küchenrolle und legt den Rost auf den Topf.

Desinfektion von reifen Samen:

Die Samen wie folgt in ein Kaffeefilterkuvert einpacken.

Samen verpacken Samen verpacken Samen verpacken Samen verpacken Samen verpacken Samen verpacken

In ein saubers Glas ca. 1 cm 3 % Wasserstoffperoxid füllen und das Samenkuvert hineingeben. Das Glas verschliessen und 10 Minuten leicht schwenken damit das Samenkuvert überall benetzt wird.

Aufbringen der Samen:

Alle Schritte müssen im Dampfstrom durchgeführt werden. Offene Eprouvetten und deren Verschlüsse (ausgenommen Alufolienkappen) dürfen den Dampfstrom nicht verlassen.

Zuerst nimmt man einen Wattepad, tränkt diesen in 70 % Ethanol und legt ihn auf den Gitterrost. Danach öffnet man im Dampfstrom das Glas mit dem sterilen destillierten Wasser und stellt es ebenfalls am Gitterrost ab.

steriles destilliertes Wasser abstellen

steriles destilliertes Wasser abstellen

Jetzt öffnet man im Dampfstrom das Glas in dem das Samenkuvert schwimmt und legt den Deckel, der nicht mehr benötigt wird, am Küchentisch ab. Mit der freiwerdenden Hand nimmt man die Pinzette aus dem Ethanol und flammt diese ab. Nun nimmt man mit der Pinzette das Samenkuvert und legt es in das sterile destillierte Wasser. Das Glas mit dem Wasserstoffperoxid kann am Küchentisch abgestellt werden.

Samenkuvert in steriles dest. Wasser geben

Samenkuvert in steriles dest. Wasser geben

Nachdem man das Samenkuvert ein paar Sekunden im sterilen destillierten Wasser geschwenkt hat, legt man das Samenkuvert auf den mit Ethanol getränkten Wattepad und öffnet es mit der Pinzette und einem abgeflammten Skalpell.

Samenkuvert öffnen

Samenkuvert öffnen

Das Skalpell und die Pinzette taucht man kurz in das kochende Wasser und stellt sie danach wieder zurück in den Ethanol. Jetzt nimmt man eine Eprouvette, entfernt die Alufolienkappe im Dampfstrom und legt diese auf dem mit Ethanol getränkten Küchentuch neben dem Kochtopf ab.

Alufolienkappen entfernen und ablegen

Alufolienkappen entfernen und ablegen

Als nächstes fammt man die Pinzette ab und entfernt damit den Wattepfropfen der Eprouvette der am Gitterrost abgelegt wird.

Wattepfropfen entfernen

Wattepfropfen entfernen

Ist das erledigt, flammt man die Impföse ab und entnimmt damit ein paar Samen aus dem Samenkuvert. Die Samen werden auf direktem Weg in die Eprouvette gebracht und dort am Nährmedium verteilt. Nach dem Aufbringen der Samen wird die Impföse kurz im kochenden Wasser geschwenkt und zurück in den Ethanol gestellt.

Samen entnehmen

Samen entnehmen

Samen aufbringen

Samen aufbringen

Jetzt steckt man den Wattepfropfen in die Eprouvette. Die Pinzette wird danach kurz im kochenden Wasser geschwenkt und zurück in den Ethanol gestellt.

Wattepfropfen einstecken

Wattepfropfen einstecken

Als nächstes nimmt man die Eprouvette und flammt das Ende des Wattepfropfens kurz ab (die Eprouvette dabei einmal um die eigene Achse drehen).

Wattepfropfen abflammen

Wattepfropfen abflammen

Ist das erledigt, nimmt man die Alufolienkappe und schiebt diese über den Wattepfropfen. Um die Folienkappe vor Verrutschen zu sicher versehen wir jede Eprouvette mit einem Gummiring der die Alufolie an die Eprouvettenwand drückt.

Alufolienkappen fixieren

Alufolienkappen fixieren

Einige Tipps:

Aufstellen der Kulturgläser:

Die Kulturgefässe sollten möglichst hell und warm (ca. 20 - 25 Grad) stehen. Es ist darauf zu achten, dass die Gläser keiner direkte Sonne ausgesetzt werden, weil dadurch die Temperatur im Inneren zu sehr ansteigt und möglicherweise die Pflanzen vernichtet. Weiters sollte der Ort keinen starke Temperaturschwankungen (z.B. beim Lüften am Fensterbrett im Winter) ausgesetzt sein, weil es dadurch zu Druckänderungen in den Gläsern kommen kann und unter Umständen Luft in das Glas gesaugt wird. Wir stellen unsere Kulturgläser zwischen den Orchideen am Fensterbrett und unter Kunstlicht auf. Als Beleuchtung verwenden wir T5 Leuchtstofflampen mit der Lichtfarbe 865 und zusätzlichem Reflektor. Die T5-Lampen benötigen im Vergleich zu den oft verwendeten T8-Lampen weniger Energie und geben auch weniger Wärme ab.

unser Fensterbrett unter Kunstlicht

in vitro Kulturen auf dem Fensterbrett und unter Kunstlicht


Autor: Thomas Ederer